文章来源：《广东医学》 2022年1月 第43卷第1期 专家笔谈

作者：谢丽春1， 陈运彬2△， 马廉1△

单位：1深圳市儿童医院血液肿瘤科；2广东省妇幼保健院

△通信作者

引用格式：谢丽春， 陈运彬， 马廉. CAR-T细胞免疫疗法治疗儿童急性淋巴细胞白血病的现状及发展趋势[J].  广东医学, 2022, 43(1): 11-15.

摘

要

DRAGON BOAT

FESTIVAL

嵌合抗原受体修饰的T细胞（CAR-T）这一新的靶向免疫细胞疗法在复发、难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）的治疗应用取得了重大进展，现已经获得了FDA的批准上市，是血液系统肿瘤的一种变革性治疗方法，这标志着一个个体化癌症免疫治疗的新时代已经到来。本文将对CAR-T在儿童ALL治疗的发展现状、临床生物学特性和在克服传统细胞毒性治疗挑战中的作用进行阐述，并对解决其独特不良反应的策略以及克服免疫治疗耐药机制的研究进行讨论。

【关键词】CAR-T；儿童急性淋巴细胞白血病；细胞免疫疗法；现状；挑战

【中图分类号】R733.71；R730.51

【文献标志码】A

DOI:10.13820/j.cnki.gdyx.20212478

白血病是儿童最常见的恶性肿瘤，超过3/4的为急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）［1］。在过去的50年，儿童ALL的治疗效果有了显著的提高，5年生存率约为80%，但随之而来的治疗负担是巨大的，例如短期和长期药物毒不良反应，另外，儿童复发和难治性（R/R）ALL的比例为20%，这部分预后非常差，尽管加大治疗强度，生存率也没有明显改善［2-4］。虽然异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplant，allo-HSCT）可以使一部分复发ALL患儿受益，但仍有部分是无效的［5］。因此，临床上迫切需要新的治疗方法来改善ALL的预后，并有可能取代细胞毒性化疗药物。用CD19或CD22嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)细胞免疫治疗成人和儿童R/R ALL的突破性成绩，被认为是R/R ALL的治愈性疗法［6-7］。现有两款获得FDA批准上市的CAR-T细胞生物免疫治疗产品，即Axicabatgene-ciloleucel（KTE-C19）和Tisageneleceluel（CTL019），两者都被批准用于治疗成人复发或难治性弥漫大B细胞淋巴瘤，后者是FDA批准的唯一可用于治疗成人和儿童R/R B-ALL，两者在靶向治疗诱导B-ALL和弥漫性大B细胞淋巴瘤疾病缓解甚至长期无病生存方面显示出巨大的潜力，是细胞疗法的代表［8-9］。现CAR-T细胞免疫疗法的临床试验项目数量也是激增。本中心除了开展CD19 CAR-T治疗B-ALL外，也是国内最先一批开展抗CD7 CAR-T在儿童R/R T-ALL临床研究的单位［10］。CAR-T细胞免疫治疗改变儿童ALL的整个治疗领域，但其严重的毒性反应及耐药等限制了发展和广泛传播，仍然面临许多挑战。

1

多药联合规范化化疗方案及支持性治疗，提高了儿童ALL的生存率

儿童ALL治疗效果的突破是全球各个血液协作组精心策划努力的结果，尽管各中心使用的化疗方案可能略有不同，但现有证据未能证明某一种方案优于另一种方案［11］。化疗方案的原则是多药联合轮换化疗，在过去20年许多药物在剂量和顺序上都有所增加。最近的研究表明，常规药物的剂量进一步增加不能提高无病生存率，反而会导致相当大的毒副作用。儿童R/R ALL的预后非常差，对传统治疗药物产生耐药性，对儿童肿瘤学家提出了治疗挑战［3］。

2

CAR-T细胞的生物制备、靶点选择、不良反应及治疗监测

CAR-T细胞是一种在儿童ALL治疗上具有广阔应用前景的新型生物免疫细胞制剂，CAR-T细胞与肿瘤抗原结合，不仅激发其细胞毒性作用，而且可促进CAR-T细胞体内增殖，延长CAR-T细胞寿命［8,12］。CAR-T细胞广泛分布于全身，包括中枢神经系统，使其成为髓外复发的一个非常有前景的治疗选择［13］。

2.1  CAR-T细胞生物制备  患者首先接受白细胞分离术获得自体T细胞，然后送往临床实验室对其进行体外重组，第1代CAR在临床试验中表现不佳后，研究人员相继开发了第2代、第3代和第4代CAR，并对其进行了改造，以包含额外的共刺激结构域（如CD28、4-1BB或OX40）［14］。在共刺激结构域中，4-1BB已被证明可以改善T细胞衰竭，并促进CAR在体内的寿命；而CD28则对T细胞活化更有影响力，目前大多数临床试验都使用第2代和第3代CAR，因为它们具有更优越的功效［15-16］。CAR基因的基因组整合位点也发挥了作用，CRISPR-Cas9基因编辑技术有可能选择有利的插入位点，指导细胞信号传导和染色质修饰的基因位点整合与肿瘤反应相关［17］。最近，研究人员发现T细胞记忆相关基因（包括IL-6/STAT3信号）表达的CAR-T细胞在CD19 CAR-T细胞治疗的慢性淋巴细胞白血病患者中产生了更好的治疗反应［18］。另外，CAR-T细胞制造过程中CD4+和CD8+的比例不同所发挥的抗肿瘤效应也是不同的，据Finney等［19］报道，分泌 TNF-α的CD8+ CAR-T细胞数量较多的，儿童和年轻成人B-ALL的治疗反应更好。

2.2  淋巴细胞清除性化疗方案  现淋巴细胞清除性化疗的标准方案是基于氟达拉滨和环磷酰胺。美国国家癌症研究所开展了一项包括53例儿童和青少年R/R ALL的临床试验，根据肿瘤负荷不同，分别使用不同的化疗方案。但结果显示，根据疾病负荷调整化疗方案并无益处，并且接受氟达拉滨/环磷酰胺方案的总生存期明显长于接受其他方案的受试者。一些临床研究则对由于疾病本身或之前治疗导致淋巴细胞计数低和（或）全血细胞减少的患者没有进行化疗，从风险-收益角度考虑可能是合适的，但目前数据有限，需要更多后续研究［20］。

2.3  桥接化疗方案  接受CAR-T细胞治疗的R/R ALL患者处于肿瘤活跃期，在CAR-T细胞制备完成之前、白细胞分离收集T细胞后需进行适当的桥接化疗来控制疾病的进展，目的侧重于控制疾病进展，同时尽量减少器官毒性和感染的风险。选择方案取决于患者的既往治疗史，CAR-T制备和治疗机构的配合，避免延迟CAR-T细胞输注。下表是欧洲血液和骨髓移植学会（EBMT）和美国血液和骨髓移植学会（ASBMT）的桥接化疗建议方案（表1）［21］。

2.4  CAR-T细胞常用靶点  CD19 CAR-T治疗CR的患者1年内复发的比例为43%～55%［22］，存在CD19缺失或突变的患者，无法输注二次CD19 CAR-T细胞；部分鼠源CAR-T细胞在人体内被免疫介导清除，即使白血病细胞上高表达CD19，二次输注也未能成功［21］。因此，对于接受CD19 CAR-T细胞治疗失败的患者，需要新的治疗方法例如HSCT或用抗其他B细胞抗原的CAR-T细胞产品［16,23］。

CD22在正常B细胞上限制性表达，而在大多数白血病细胞上高表达，是可替代CD19的靶点抗原。美国国立卫生研究院(National Institutes of Health, NIH)开发了具有4-1BB共刺激结构域的新型CD22-CAR［24］。研究显示大多数患者在输注CD22 CAR-T细胞后仍面临复发的难题，无法从根本上解决免疫逃逸的问题［25］。

CAR-T对T细胞恶性肿瘤临床疗效显著，但一些因素限制其临床可行性。首先，正常T细胞和恶性肿瘤CAR-T细胞表达共同抗原谱会导致自相残杀；第二、获取足够数量无癌细胞污染的自体正常T细胞是一项技术挑战，成本高昂；第三、异体来源的CAR-T细胞可能会导致危及生命的GVHD。现有研究使用CRISPR/Cas9基因编辑技术来制备CD7 CAR-T细胞，有望构建有效靶向杀死恶性肿瘤的CAR-T细胞，又可避免“自相残杀”［26］。

2.5  CAR-T细胞疗法的不良反应  CAR-T细胞治疗的不良反应发生率约为95%，大部分是自限性的，但有一些是危及生命的严重毒性反应，最常见的并发症是细胞因子释放综合征（CRS）、神经毒性和B细胞再生障碍［27］。

2.5.1 CRS CRS是最严重的并发症，CAR-T细胞溶解B细胞时释放的细胞因子（包括IL-6）引起的，与治疗反应相关，通常发生在细胞输注后几天内，最晚发生时间是3周，通常是可逆的［28］，但是也有发生严重难治性休克伴致命性多器官衰竭，具有类似噬血细胞性淋巴组织细胞增多的临床表现和细胞因子特征［29］。

CRS的临床表现为：发热、缺氧、毛细血管渗漏伴血流动力学不稳定、多器官功能障碍包括神经功能障碍。危险因素包括：高肿瘤负荷（骨髓白血病细胞＞50%）、环磷酰胺和氟达拉滨的淋巴细胞清除化疗方案、输注CAR-T细胞剂量、基于CD28的CAR-T结构和存在活动性感染等。患儿接受淋巴细胞清除性化疗后，髓外疾病仍在迅速发展或存在活动性感染，建议避免输注CAR-T细胞［27］。

CRS分级系统现已报道的至少有6种，为了协调各个分级系统，美国血液和骨髓移植学会（ASBMT）发布了一个分级共识［30］。该共识提出，CRS的必要症状是：不可归因于其他任何因素的发热，级别取决于低血压和（或）缺氧的程度。迄今为止，尚无有效的模型可预测CRS的严重程度，许多已鉴定的生物标志物（如CRP、IL-15）未能得到很好的复制，其预测价值仍处于探索阶段，未来研究方向是在更大规模的临床研究中去预测和验证。

托珠单抗是一种重组人源化抗人白细胞介素-6 (IL-6)受体单克隆抗体。2017年FDA批准用于治疗2岁以上儿童接受CAR-T细胞治疗的CRS相关毒性，可阻断IL-6迅速改善 CRS 症状，并且不会影响CAR-T细胞的扩增、功能或持久性［31］。

预防CRS策略：(1)探索CAR-T细胞给药剂量策略，在不影响疗效的情况下，分次爬坡式给药。(2)肿瘤高负荷患者早期使用托珠单抗，评价4级CRS的发生率以及CAR-T细胞的疗效（ClinicalTrials.gov NCT02906371）［32］。

2.5.2  神经毒性  第二常见毒性是免疫效应细胞相关神经毒性综合征（immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS），血脑屏障通透性增加导致高浓度的促炎细胞因子（如IL-6、IFN-γ和TNF-α）进入脑脊液［27］。

临床表现涵盖了各种神经系统症状，如头痛、震颤、言语障碍、谵妄和意识混乱等，最常见的是神志不清，占66%；最严重的是癫痫和脑水肿。美国移植与细胞治疗学会（American Society of Transplant and Cellular，ASTCT）制定了一个基于康奈尔大学儿童谵妄筛查工具的儿童ICANS分级标准化体系［30］。类固醇激素和支持性治疗是主要治疗手段，大多数患者康复后没有任何长期神经系统后遗症。CRS发生通常先于ICAN，两者出现时间重叠也是常见的，但没有发生严重CRS而出现严重ICAN的情况是罕见的［21］。

2.5.3  B细胞生成障碍  患者B细胞再生障碍持续时间超过6个月预示较好预后， B细胞早期恢复的复发风险更高，因此监测B细胞可指导患者后续是否需HSCT［8］。

2.6  CAR-T后HSCT巩固治疗选择  患者CD19 CAR-T细胞治疗后CR的，如果从未接受过HSCT，是否需要后续进行HSCT来巩固CR，EBMT和ASBMT的专家共识指出：建议根据患者个体因素（可用供体、并发症）、疾病相关因素（MRD和B细胞再生障碍）和CAR-T相关因素（共刺激域和持久性）来评估其是否接受HSCT作为巩固疗法［30］。

2.7  监测CAR-T治疗反应 建议3～4周后进行治疗反应评估，4周后出现治疗反应的可能性非常小。评估项目与传统化疗疗效评估相似，包括：血常规、骨髓活检和骨髓细胞学、腰椎穿刺（有或无中枢神经系统受累史）。MRD的检测方法包括：二代测序免疫球蛋白重链基因重排检测法和流式细胞术检测法，两者各有优缺点，流式细胞术检测有助于确定具有治疗意义的表面标志物（尤其是CD19，但也包括CD22和CD20），而NGS的检查敏感度更高，最高可达10-6，并可以追踪导致复发的小亚克隆，检测更深层次的MRD有助于评估复发风险。

在脑脊液中观察到的形态异常细胞可能是CAR-T细胞，而不是白血病幼稚细胞，流式细胞术可能有助于区分CAR-T细胞和残留的白血病幼稚淋巴细胞。

对于CD19 CAR-T细胞治疗后未接受后续治疗的患者，推荐的监测方案为：随访监测时长至少3个月，有许多临床试验长达1年。前6个月每月1次检测血常规、骨髓活检、骨髓细胞学和MRD；6～12个月内每3个月1次［21］。

3

CAR-T细胞治疗面临的挑战

3.1  制备时间长和工艺复杂  在tisagenlecleucel的Ⅱ期临床研究中，7例患者因“产品相关问题”未输注细胞，而另外7例患者则因疾病进展死亡未能输注，因此需对CAR-T制造和运输过程进行改进，加快产品周转时间［8］。

3.2  价格昂贵  CAR-T细胞价格非常昂贵，tisagenlecleucel单次输注的标价是47.5万美元，这不包含托珠单抗或其他维持持久缓解治疗（例如HSCT）的支持性治疗费用，将给患者、医疗保障系统和保险公司带来挑战［33］。

3.3  CAR-T细胞治疗后耐药复发机制及相应对策  CD19 CAR-T细胞疗法在治疗R/R B-ALL的成功是突破性的，但复发比例超过50%，主要原因是抗原丢失免疫逃逸和CAR-T细胞功能丧失［21］。

抗CD19 CAR-T细胞抗原丢失最常见的原因是CD19剪接变异体和突变导致错误折叠的蛋白质被困在内质网［21,34］。另外持续暴露于免疫治疗可能通过应激进化诱导抵抗，CAR-T细胞体内持续时间较长的，CD19阴性表型复发比率较高，但即使是短期靶向也可能导致足够的压力来诱导这种形式的复发［20,35］。抗CD22 CAR-T细胞复发的则是抗原密度降低而不是完全丢失［24］。第2种机制是谱系转换，主要见于MLL重排、BCR-ABL1+、ZNF384重排和其他亚型ALL，前两个亚型即使CD19 CAR-T细胞体内持续存在，其复发风险也是增高的，需要额外的巩固治疗［36-37］。

另一种机制是胞啃（trogocytosis）作用，即白血病细胞将靶抗原转移到CAR-T细胞表面，进而导致CAR-T细胞之间相互攻击，自相残杀［16］。CD19阴性复发的还有个罕见机制是在CAR-T细胞制备过程中，CAR基因整合到白血病细胞中，CAR-T的svFv与白血病细胞上的 CD19结合，使其无法识别白血病细胞［38］。

许多研究者采用了多种靶抗原的先发制人疗法。例如探索CD19 CAR-T和CD22 CAR-T联合治疗，通过依次输注CD19和CD22 CAR-T细胞的“鸡尾酒”或双靶点CAR-T细胞来实现［14］。在20例R/R ALL患儿中，连续性输注CD19和CD22 CAR-T细胞，效果令人惊喜，治疗反应持久性强，18个月的无病生存率为79.5%，远高于以前单个靶抗原CAR-T细胞。双靶点CD19/CD22 CAR-T细胞的的制备虽具有挑战性现已经完成，现在临床试验阶段（NCT03448393）［39］。

通过抑制肿瘤相关抑制信号以及微环境的免疫抑制作用可增强CAR-T细胞有效性，但是会导致T细胞衰竭和缺乏长期持久性。现正在进行将CAR-T细胞和免疫检查点阻断抑制剂组合的研究，但这种结合可能会引发过度的免疫刺激。修改CAR-T细胞以分泌程序性细胞死亡蛋白-1 (PD-1) 阻断scFv和细胞因子（例如 IL-12、IL-18 等），将局部微环境转化为促炎状态，因为分泌的scFv仍然可定位于肿瘤，保护CAR-T细胞免受PD-1抑制，这可避免全身免疫检查点抑制相关的毒性，提高安全性［40］。

4

展望

CAR-T细胞疗法是目前最具应用前景的靶向免疫治疗，未来应着眼于开发更好的预后模型，包括关键的生物标志物、CAR-T产品的特点、细胞剂量和细胞因子血清浓度等。CRS和ICANS实验模型（如人源化小鼠、非人灵长类动物）的开发将确定靶向通路并指导未来的临床试验。

可以控制CAR-T细胞免疫治疗的毒性反应，转移到一线治疗是临床试验的焦点，不仅可改善常规治疗，而且可取代细胞毒性治疗的组成部分，改善预后和减少长期影响。

2021年6月，中国NMPA正式批准国内首个靶向人CD19自体CAR-T细胞治疗产品奕凯达上市，CAR-T治疗在儿童B-ALL的临床研究前景广阔，适用于儿童ALL的CAR-T产品在国内上市也是指日可待。

参考文献（略）